聽老師將講HPLC的計算

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HPLC中涉及到計算的，主要是流動相配制和含量計算。RP-HPLC一般用緩沖鹽配合甲醇乙腈作為流動相，計算主要涉及到如何配制流動相的問題。同時還要考慮到流動相配制的數(shù)量問題。HPLC計算主要運用外標(biāo)法。內(nèi)標(biāo)法在HPLC分析中，運用不多。所以略講。

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1、流動相配制的計算

流動相在HPLC中起到運輸樣品的作用。而流動相準(zhǔn)確地配制，在HPLC測試中有著重要的作用。準(zhǔn)確地配制流動相能夠保證測試中保留時間的重復(fù)性。所以，配制起來不能掉以輕心。

對于流動相配制，我把它概括為以下幾個字。

計算，稱量，溶解，調(diào)節(jié)，<混合>，過濾，脫氣。為什么我把“混合"外加了個框呢？這就是涉及到你的設(shè)備是否是單元泵還是多元泵的問題了。如果只有一臺單元泵，也無電磁閥切換功能的泵，需要混合這個步驟，而多元泵，或者低壓梯度切換的，可以不需要所謂的混合。各走各的。

打個比方說，如果我的流動相是：甲醇：純水=60：40（v/v），對于單元泵，那么只能甲醇和純水混合，作為流動相，而多元泵或者多元梯度泵，則可以有兩路，A路放甲醇， B路放純水，A與B各比例控制為60%，和40%。

對于HPLC 配制流動相，要保證流動性配制準(zhǔn)確，也要保證流動相配制足量，不多不少，這樣保證在這批測試中，流動相不至于不夠，也不致于太多而浪費，流動相一般需要在2-3天內(nèi)用完。那么首先確定流動相要配制多少。舉一個例子。

例

要分析30個樣品，10個對照品，樣品和對照品都分析2次。一個試樣分析20分鐘，流速為1.2ml/min。那么我要配制多少ml的流動相呢？通過計算來解決。（注：自動進樣，連夜分析，可以設(shè)置停止泵程序）

一般來說，試樣設(shè)置20分鐘，還需要考慮進樣的時間。假設(shè)進樣時間為三分鐘，那么一個試樣所需要的時間為23分鐘。我們可以計算：

根據(jù)計算，需要配制2208ml流動相。對于流動相，我們不能配制得太摳，需要考慮到吸濾頭占的空間，那么我們再多配制個100-300ml，這取決于你的瓶底胖瘦。能夠保證不被吸空為宜。那么我們就配制2500ml吧。

對于流動相如何配制，我們給一個實例

比如我要測試中藥一清膠囊，我們翻閱中國藥典，得以下信息。

一清顆粒是由黃連，大黃，黃芩（qin）組成。一般用于清熱瀉火解毒，化瘀涼血止血。用于火毒血熱所導(dǎo)致的身熱煩躁，目赤口瘡，咽喉牙齦腫痛，大便秘結(jié)，吐血，咯血咽喉炎，扁桃體炎，牙齦炎等上述癥候者。

其中黃芩主要成分黃芩苷用HPLC方法測試。先摘入如下：

色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液（pH=2.7）(42:58 v/v)為流動相，檢測波長為275nm。有效塔板數(shù)按黃芩苷峰計算不低于5000

我們看到，其流動相是：甲醇-0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液（pH=2.7）(42:58 v/v)，那么也就是說有水相識0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液，其pH=2.7（用磷酸調(diào)節(jié)），有機相是甲醇。

要注意，對于HPLC用的試劑，水，溶劑，都是需要好的。試劑一般在分析純以上。最好用優(yōu)級純，溶劑一般用HPLC級別。水用超純水。所有的溶劑，溶液，都需要用0.45微米（或更細(xì)）的微孔濾膜濾過。也要保證溶劑瓶清洗干凈。干燥。

流動相脫氣是很重要的，現(xiàn)在一般的儀器都有在線脫氣。當(dāng)然，在配制流動相前脫氣，亦重要。一般脫氣又抽真空脫氣，超聲波脫氣，吹He脫氣，加熱回流脫氣等。常用的是前兩個脫氣方法。當(dāng)然，抽真空脫氣效率比較高，但是要注意有機相是否在抽真空后比例改變的問題。所以，對于混合兩相的流動相，最好單獨濾過，再混合。混合后一般會產(chǎn)生氣體，用效率略低的超聲波脫氣即可。超聲波脫氣，只要看到無明顯氣泡即可使用。

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二．含量計算

對于HPLC，我們一般使用外標(biāo)法計算。那么有同學(xué)問，那么為什么內(nèi)標(biāo)法很少在HPLC上使用呢?

那么我們看下氣相色譜和HPLC不同的進樣方式。GC手動進樣還是依靠進樣針的定量進樣，因為進樣量很少，以微升計，所以，稍稍不留神，就有可能多進或者少進樣。而且，進樣針上的刻度也很粗，所以，GC用手動進樣，使用外標(biāo)法確實很考驗測試者的嫻熟技巧和過人的眼力。而內(nèi)標(biāo)法在GC進樣測試中，由于內(nèi)標(biāo)物的調(diào)節(jié)作用，可以使得由于進樣誤差降低到最小，其相關(guān)的文章，查閱qinqingcao在本論壇的文章。但是HPLC進樣是六通閥進樣，其有一根定量環(huán)，如果手動進樣能夠保證定量環(huán)是充滿樣品溶液的，那么進樣誤差就幾乎不存在。況且內(nèi)標(biāo)法需要尋找合適的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，同時配制內(nèi)標(biāo)物，比較麻煩，所以在HPLC中很少聽說用內(nèi)標(biāo)法定量計算。更多的，是使用外標(biāo)法計算。

所以，HPLC手動進樣一般使用3倍量的定量環(huán)進樣。也就是說，20微升的定量環(huán)，我要注入60微升以上的樣品溶液。保證定量環(huán)中充滿著樣品溶液。而多余的樣品溶液會被排除。這樣保證每次進樣都是定量環(huán)中的那些量。對于定量環(huán)，這個體積一般也不是正好是20.00微升，但是我們保證進樣過量（多余的溶液會被排出），則能夠保證進樣都是按照定量環(huán)中的體積進入色譜系統(tǒng)，這樣消除進樣的誤差。對于定量環(huán)，在做完樣品后需要用無溶質(zhì)的流動相清洗數(shù)遍。如果定量環(huán)真的很臟，無法清洗了，那么可以裁剪一段管徑和定量環(huán)相同的干凈的不銹鋼管，裁剪長度和定量管相同，安裝上去。當(dāng)然資金充裕的話，也可以購買廠家的定量環(huán)。

當(dāng)然現(xiàn)在自動進樣器很普及，那么使用自動進樣器就更加方便了。

對于外標(biāo)法，實際上也就是用已知濃度的對照品（標(biāo)準(zhǔn)品）來對樣品中的該物質(zhì)。這實際上很象砝碼和天平。標(biāo)準(zhǔn)品就如同砝碼，在同樣的色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積和濃度已知，而樣品中的峰面積可以測試出來，這樣通過比例式子比較出樣品中該物質(zhì)的濃度了。

在這里，我想和大家說明的是，一般是通過保留時間做定性的。比方說，我測試維生素C，維生素C標(biāo)準(zhǔn)品在一定的色譜條件下，其保留時間為2.4分鐘；樣品在同樣的色譜條件下，2.4分鐘有峰，一般認(rèn)為是樣品中也許有維生素C。當(dāng)然，保留時間定性確實有其局限，但是沒有其他手段，那么保留時間還是能夠發(fā)揮定性的作用。

對于定量，外標(biāo)法定量，如果做的準(zhǔn)確的話，需要用多點（濃度）定量。然而在企業(yè)用單點法定量還是很多的。對于做線性，精密度，回收率，這些內(nèi)容我們在方法學(xué)驗證中講授，這里我還是著重講解單點法校正。

在講單點法校正，我先問同學(xué)們一個問題，如何用簡單的方法來測試校園中的樹高度？

通過一根已知高度的biao桿，在太陽下投射在地面的陰影的長度，計算出樹的高度。同樣道理，我們也是用已知的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和峰面積，用樣品中同一物質(zhì)的面積，計算出樣品中的那個物質(zhì)的濃度。根據(jù)稀釋倍數(shù)計算出樣品中，該物質(zhì)的含量。

如果與標(biāo)準(zhǔn)曲線聯(lián)系起來，這個就是單點法。也就是說，以0為圓心，標(biāo)準(zhǔn)品濃度和面積在二元坐標(biāo)的一點的連線作為校準(zhǔn)曲線。得y=ax 其中的a就是斜率，也就是面積隨著濃度的變化而變化，其變化率為a。

那么樣品濃度的計算，就是按照其峰面積在坐標(biāo)上的點，對應(yīng)的濃度。用以下公式計算。

單點法：

我們給出一個例題。

例

測試果汁中維生素C含量。配制20mg/100ml的維生素C作為標(biāo)準(zhǔn)品。稱取20.005g果汁到50ml容量瓶中，加入流動相溶解定容搖勻。濾紙過濾。吸取濾液10ml到50ml容量瓶中。流動相定容搖勻。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均吸取20μl進色譜，分別得到峰面積24336（標(biāo)準(zhǔn)品），20129（樣品）。計算果汁中維生素C含量（mg/100g）

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